BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM.U nguyên bào thần kinh đệm – Glioblastoma (GB) là một trong các khối u não phổ biến nhất, chiếm 18,5% của tất cả các khối u não ở Hoa Kỳ [1]. Tổ chức Y tế Thế giới phân loại Glioblastoma như một u tế bào hình sao (Astrocytoma) cấp III và IV với độ ác tính cao. Glioblastoma multiforme được xem như u nguyên bào thần kinh đệm độ IV là loại u trong sọ ác tínhnhất. Tỷ lệ Glioblastoma là khoảng 3,19/100.000 dân, độ tuổi trung bình pháthiện là 64 tuổi và tỷ lệ này mắc ở nam là cao hơn so với nữ [2]. Glioblastoma là loại u rất ác tính, thường hình thành trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện triệu chứng. Do đó, biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 15 tháng [2] [3].

Hiện nay, việc chẩn đoán và phân loại u có thể dựa vào lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, mô bệnh học. Các phương pháp này rất hạn chế, thường chỉphát hiện khi khối u đã phát triển lớn, can thiệp ít hiệu quả. Vấn đề cần thiếtnhất hiện nay đối với căn bệnh này là chẩn đoán sớm và điều trị sớm. Do đó, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu bệnh học phân tử trong GB. Sựbiến đổi gen bao giờ cũng biến đổi sớm nhất, tiếp theo là sự biến đổi về protein trước khi có sự biến đổi về hình thái và chức năng tế bào trong ung thư. Điều này giúp chúng ta tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình bệnh học ung thư để có thể can thiệp sớm và hiệu quả.
Trong GB, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra sự biến đổi một sốgen, trong đó EGFR là gen có tỷ lệ đột biến cao với tỷ lệ khoảng 43% [4].Các nghiên cứu đã góp phần sáng tỏ nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh trongGB, xác định nguy cơ mắc thể ác tính này và hướng tới điều trị đích. Do đó,việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen EGFR là rất2cần thiết, hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng có thể phân loại, tiên lượng khả năngmắc thể GB của bệnh nhân u não. Bên cạnh đó, trên thị trường đang phát triển rất mạnh mẽ dòng thuốc ức chế ung thư qua EGFR đã được chứng minh hiệuquả trên nhiều ung thư ở các cơ quan khác nhau liên quan đến đột biến gen EGFR. Do đó, xác định đột biến gen còn hỗ trợ chỉ định điều trị đích với trường hợp đột biến EGFR bằng cách kết hợp sử dụng thuốc ức chế EGFR cùng các phương pháp điều trị khác.
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật tiên tiến để xác định đột biến gen như:PCR–RFLP, giải trình tự gen, Scorpions ARMS, SMAP (Smart AmplificationProcess). Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen hiện đang được sử dụng rất phổ biến tại các phòng thí nghiệm; Scorpion ARMS đắt tiền và chưa được áp dụng rộng rãi; SMAP còn đang trong quá trình thử nghiệm và hoàn thiện. Vìvậy, trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác địnhđột biến gen EGFR, với giá thành dịch vụ rẻ và quy trình kỹ thuật không quá phức tạp.
Với mục đích xây dựng quy trình xác định đột biến gen chính xác, phùhợp với điều kiện bệnh nhân và kinh tế ở Việt Nam, nghiên cứu này được xây dựng với mục tiêu:
1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến tại gen EGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Bước đầu nghiên cứu xác định độ biến gen EGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

MỤC LỤC BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 8
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………. 3
1.1 Tổng quan u não………………………………………………………………………….. 3
1.1.1 Tỷ lệ mắc u não……………………………………………………………………… 3
1.1.2 Nguyên nhân gây u não ………………………………………………………….. 4
1.1.3 Phân loại u não………………………………………………………………………. 4
1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) …………. 9
1.1.5 Triệu chứng lâm sàng …………………………………………………………… 10
1.1.6 Chẩn đoán cận lâm sàng ……………………………………………………….. 13
1.1.7 Điều trị u não ………………………………………………………………………. 15
1.2 Gen mã hóa EGFR và con đường khuếch đại tín hiệu ……………………. 16
1.2.1 Gen mã hóa EGFR……………………………………………………………….. 16
1.2.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR)……………………………… 17
1.2.3 Đột biến gen EGFR………………………………………………………………. 19
1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến gen Glioblastoma . 20
1.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen – PCR và PCR lồng ………………………….. 20
1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen(Sequencing) …………………………………… 25
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 27
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……………………………………………….. 27
2.1.1 Thời gian nghiên cứu……………………………………………………………. 27
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu……………………………………………………………… 27
2.2 Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………… 27
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu ……………………………………… 272.3.1 Thiết bị phòng nghiên cứu…………………………………………………….. 27
2.3.2 Dụng cụ………………………………………………………………………………. 28
2.3.3 Hóa chất sử dụng …………………………………………………………………. 28
2.4 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………. 29
2.5 Quy trình kỹ thuật ……………………………………………………………………… 30
2.5.1 Lấy mẫu mô paraffin…………………………………………………………….. 30
2.5.2 Tách DNA từ mẫu mô ………………………………………………………….. 30
2.5.3 Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA ……………………………… 32
2.5.4 PCR khuếch đại đoạn gen EGFR……………………………………………. 33
2.5.5 Giải trình tự gen phát hiện đột biến gen ………………………………….. 36
2.6 Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………………………………… 38
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………….. 39
3.1 Kết quả tách chiết DNA…………………………………………………………….. 39
3.1.1 Kết quả đo nồng độ và mật độ quang ……………………………………… 39
3.1.2 Kết quả điện di DNA tổng số ………………………………………………… 41
3.2 Kết quả PCR khuếch đại exon 21 gen EGFR ………………………………… 41
3.3 Kết quả giải trình tự gen …………………………………………………………….. 42
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN…………………………………………………………………. 44
4.1 Kết quả tách chiết DNA……………………………………………………………… 44
4.2 Kết quả PCR lồng khuếch đại exon 21…………………………………………. 45
4.3 Kết quả giải trình tự exon 21 gen EGFR ………………………………………. 46
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………….. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC