Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch.Rắn độc cắn là một cấp cứu ngộ độc thường gặp. Theo các chuyên gia ước tính, ở nước ta hàng năm có khoảng 30000 trường hợp bị rắn cắn [71]. Thủ phạm gây ra các vết cắn có độc chủ yếu thuộc hai họ rắn hổ và rắn lục [12], [13]. Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn [3].
MÃ TÀI LIỆU
|
CAOHOC.2017.01433 |
Giá :
|
50.000đ
|
Liên Hệ
|
0915.558.890
|
Một trong những loài rắn hổ mang thường gặp và hay gây ra tai nạn rắn cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra, hay còn được gọi là rắn hổ mang bành. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn,nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân sau khi sống sót [4]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn, chế tạo từ huyết thanh động vật được gây miễn dịch [124]. Thế nhưng, điều kiện tiên quyết cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm.
Hơn thế nữa, ngay cả tại các bệnh viện tuyến cuối, việc xác định loài rắn và lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn thường cũng chỉ thực hiện được khi các biểu hiện lâm sàng đã rõ, điều này dẫn đến sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn muộn, chủ yếu để cứu tính mạng nạn nhân chứ chưa hạn chế được nhữngdi chứng tổn thương do nọc độc gây ra. Chính vì vậy, việc xác định chính xác nọc độc của của loài rắn gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa giúp sơ cấp cứu đúng cách vừa định hướng lựa 2chọn đúng loại Huyết thanh kháng nọc rắn để sử dụng, đem lại hiệu quả điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân. Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất là protein [1], [2], [14], [16]. Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao[42], [49]. Nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét nghiệm miễn dịch dựa vào tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên nọc rắn với các kháng thể đặc hiệu có trong thành phần của bộ xét nghiệm. Ở Việt nam, Hà Thị Hải và cộng sự đã nghiên cứu thành công bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra [7]. Tuy nhiên, ở khía cạnh giúp phát hiện nhanh nọc rắn bộ xét nghiệm khó có thể được coi như một xét nghiệm cấp cứu do có thời gian tiến hành tương đối dài. Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã được nhiều tác giả trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét nghiệm phát hiện nọc rắn [5], [29], [107]. Xét nghiệm dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch là kỹ thuật có nhiều ưu điểm như có độ nhạy cao trong khi thời gian tiến hành nhanh, kỹ thuật này cũng dễ triển khai và có thể sử dụng trên
thực địa [123]. Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự cũng đã áp dụng nguyên lý này để phát triển bộ xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có những thành công nhất định [59]. Qua đó có thể thấy việc nghiên cứu chế tạo bộ kít chẩn đoán nhanh rắn hổ mang Naja atra cắn với nguyên lý sắc ký miễn dịch là thích hợp với điều kiện thực tế ở Việt nam, nơi mà tai nạn rắn độc cắn thường xuyên xảy ra ở các khu vực nông thôn và miền núi, những nơi xa các trung tâm y tế.
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu:
1. Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch.
2. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm trên thực nghiệm và lâm sàng.
MỤC LỤC Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ……………………………………………………………………. 3
1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam ………………………….. 3
1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam ………………………………………………………….. 3
1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam ………………………………………………. 5
1.2. Rắn hổ mang Naja atra ……………………………………………………………………… 6
1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc ……………………………………………………… 6
1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn …………………………………………… 9
1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng
nọc rắn ………………………………………………………………………………………………….. 12
1.3.1. Điện di miễn dịch ……………………………………………………………………… 13
1.3.2. Ngưng kết hồng cầu ………………………………………………………………….. 13
1.3.3. Ngưng kết miễn dịch …………………………………………………………………. 14
1.3.4. Miễn dịch phóng xạ …………………………………………………………………… 15
1.3.5. Miễn dịch huỳnh quang ……………………………………………………………… 16
1.3.6. Miễn dịch quang ……………………………………………………………………….. 16
1.3.7. Miễn dịch gắn enzym ………………………………………………………………… 17
1.3.8. Kít phát hiện nhanh …………………………………………………………………… 18
1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch ……………………………………………………………….. 19
1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển ………………………………………………….. 19
1.4.2. Nguyên lý hoạt động …………………………………………………………………. 21
1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử ………………………………………………………….. 23
1.5. Kháng thể kháng nọc rắn………………………………………………………………… 26
1.5.1. Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn ………………………….. 26
1.5.2. Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn ………………………….. 30
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………. 33
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………… 33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………………….. 33
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu …………………………………………………………………… 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………………………. 35
2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn …………………………………… 36
2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch ……………………………………. 37
2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh ……………………. 39
2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ……………………………………………….. 40
2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên
nọc rắn ………………………………………………………………………………………………….. 45
2.2.6. Hấp phụ miễn dịch ……………………………………………………………………. 45
2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể ……………………………………………. 46
2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp …………………………………………………… 49
2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh ………………………………………………… 50
2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm ………………………………… 55
2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu
bệnh phẩm …………………………………………………………………………………………….. 55
2.3. Xử lý số liệu ………………………………………………………………………………….. 56
2.4. Đạo đức nghiên cứu ……………………………………………………………………….. 56
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………………….. 57
3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra
từ thỏ và gà ……………………………………………………………………………………………. 57
3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ……………… 57
3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch ………….. 58
3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng
nọc rắn ………………………………………………………………………………………………….. 60
3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc
rắn của các loài khác ………………………………………………………………………………. 61
3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và
trứng gà …………………………………………………………………………………………………. 62
3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể …………………………………………………….. 62
3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch …… 63
3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch ……………. 64
3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng
nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa ………………………………… 65
3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể
bằng kỹ thuật Western blot ……………………………………………………………………… 65
3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên
nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch ……………………………………… 66
3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể ……………………………………………………….. 68
3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA ……………. 68
3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng
trực tiếp …………………………………………………………………………………………………. 69
3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng ………………………………….. 70
3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng ………. 70
3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp với
hạt nano vàng ………………………………………………………………………………………… 71
3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra …. 72
3.6.1. Hệ đệm ……………………………………………………………………………………. 72
3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện ……………………………………………. 73
3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng ……………………………………………….. 74
3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp ……………………………………………………… 74
3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện
nhanh ……………………………………………………………………………………………………. 75
3.7.1. Giới hạn phát hiện …………………………………………………………………….. 75
3.7.2. Phản ứng chéo ………………………………………………………………………….. 76
3.7.3. Độ ổn định của bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh ……………………….. 76
3.7.4. Bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang …………………….. 77
3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên
lâm sàng ………………………………………………………………………………………………… 77
3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ………………………………………………….. 77
3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ……. 78
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………… 85
4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ
thỏ và gà ……………………………………………………………………………………………….. 85
4.1.1. Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra …………………………. 85
4.1.2. Lựa chọn loài gây miễn dịch ………………………………………………………. 86
4.1.3. Tạo kháng nguyên và quy trình gây miễn dịch ……………………………… 87
4.1.4. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng
nguyên nọc rắn ………………………………………………………………………………………. 88
4.1.5. Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và
trứng gà …………………………………………………………………………………………………. 89
4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn
hổ mang Naja atra ………………………………………………………………………………….. 91
4.3. Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra ……………… 93
4.3.1. Lựa chọn nguyên liệu cho bộ kít …………………………………………………. 93
4.3.2. Tối ưu hóa quy trình cộng hợp ……………………………………………………. 94
4.3.3. Tối ưu hóa hệ đệm và các hóa chất xử lý màng …………………………….. 96
4.3.4. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể ……………………………………………………. 97
4.4. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra trên
in vitro ………………………………………………………………………………………………….. 99
4.5. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng …………….. 102
4.5.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ………………………………………………… 102
4.5.2. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên mẫu
lâm sàng ………………………………………………………………………………………………. 103
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………… 109
KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………………………….. 110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA LUẬN ÁN ………………………………………………………………………………….. 111
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………… 112
PHỤ LỤC …………………………………………………………………………………………… 126
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA LUẬN ÁN
1. Nguyễn Ngọc Tuấn, Trịnh Thanh Hùng, Đặng Hồng Thanh, Nguyễn Đặng Dũng (2016), “Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra”, Tạp chí Y – Dược học Quân sự, (1), tr. 77-84.
2. Nguyễn Ngọc Tuấn, Trịnh Thanh Hùng, Nguyễn Trung Nguyên, Nguyễn Đặng Dũng (2016), “Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể sử dụng cho chế tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra”, Tạp chí Y – Dược học Quân sự, (2), tr. 35-43.112
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Trương Nam Hải (2006), “Khảo sát các chất có hoạt tính sinh học trong nọc rắn hổ mang Naja naja”, Tạp chí Hóa học, 44(1), tr. 57-61.
2. Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Đặng Trần Hoàng và cs (2006), “Tách các neurotoxin từ nọc rắn hổ mang Việt nam (Naja naja)”, Tạp chí Hóa học, 44(4), tr. 449-453.
3. Bệnh viện Bạch mai (2015), Số liệu thống kê trên phần mềm quản lý của Trung tâm chống độc năm 2015, Bệnh viện Bạch Mai, Hà nội.
4. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và xử trí ngộ độc, Ban hành theo quyết định số 3610/QĐ-BYT ngày 31/8/2015 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
5. Đỗ Khắc Đại (2013), Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát
hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt
nam, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân y.
6. Lê Văn Đông (2010), Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm miễn dịch
chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam, Báo cáo kết quả Đề tài KCB-04.06.01, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng.
7. Hà Thị Hải (2015), Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Miền bắc Việt nam, Luận văn Thạc sĩ Y học, Học viện Quân y.
8. Hoàng Mạnh Hùng (2010), Nghiên cứu phát hiện, truy nguyên nguồn gốc heroin và ma túy tổng hợp, Báo cáo kết quả Đề tài KC.04.06/06-10, Viện Khoa học Hình sự, Bộ Công an.
9. Phạm Mạnh Hùng, Nguyễn Đặng Dũng, Lê Văn Đông (2011), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, Hà Nội. 113
10. Trịnh Xuân Kiếm, Lê Thị Hồng Hạnh (2009), “Chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn, ứng dụng lâm sàng tại Việt nam”, Tạp chí Y học Việt nam, (2), tr. 11-15.
11. Trần Kiên, Nguyễn Quốc Thắng (1995), Các loài rắn độc ở Việt nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội.
12. Ngô Ngọc Quang Minh (2005), “69 trường hợp rắn độc cắn tại Bệnh viện Nhi đồng 1”, Y học Thực hành, (2), tr. 55-58.
13. Nguyễn Kim Sơn (2008), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và điều trịbệnh nhân bị một số rắn độc trên cạn cắn thuộc họ rắn hổ (elapidae) ởMiền bắc Việt nam, Luận án Tiến sĩ, Đại học Y Hà nội.
14. Nguyễn Hồng Thanh, Nguyễn Kim Tấn, Trương Nam Hải (2009), “Nghiên cứu các thành phần của nọc rắn hổ đất (Naja Kaouthia)”, Tạp
chí Sinh học, 31(2), tr. 89-94.
15. Ngô Võ Kế Thành, Nguyễn Đăng Giang, Lâm Quang Vinh và cs (2013), “Nghiên cứu tổng hợp nano vàng và khảo sát khả năng gắn kết với kháng thể kháng vi khuẩn E. coli O157”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 16, tr. 75-82.
16. Trần Đình Toại (2006), “Nghiên cứu chiết tách và tính chất của toxin và một số enzym thủy phân có hoạt tính sinh học từ nọc rắn hổ mang Việt Nam Naja Naja”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý, Sinh học, (4), tr. 65-72.
17. Trần Thị Phương Túy, Nguyễn Duy Thăng, Nguyễn Văn Tránh và cs (2011), “Tìm hiểu một số đặc điểm của bệnh nhân bị rắn cắn vào điều trị tại Bệnh viện Trung ương Huế”, Tạp chí Y học Việt nam, (đặc biệt), tr. 13-18.
18. Đinh Thương Vân (2010), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclono-Antibody) để chẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi, Báo cáo tổng kết Đề tài KC.06-16/06-10, Viện Công nghệ sinh học