Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisinin-piperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành tại Việt Nam.Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, do ký sinh trùng Plasmodium spp. của ngƣời gây nên. Bệnh lây theo đƣờng máu, do muỗi Anopheles spp. truyền bệnh. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2021), trên toàn thế giới năm 2020 ƣớc tính có khoảng 241 triệu ca mắc sốt rét, 627.000 ngƣời tử vong. Số mắc sốt rét tăng khoảng 14 triệu ca bệnh và tăng khoảng 69.000 ngƣời tử vong so với năm 2020, trong đó có khoảng 47.000 ngƣời chết liên quan đến việc bị gián đoạn cung cấp các biện pháp phòng chống, chẩn đoán, điều trị bệnh trong bối cảnh đại dịch Covid. Khu vực châu Phi chiếm 90% số ca mắc và tử vong sốt rét trên thế giới [107], [108].
MÃ TÀI LIỆU
|
CAOHOC.2022.00414 |
Giá :
|
50.000đ
|
Liên Hệ
|
0915.558.890
|
Ở Việt Nam theo số liệu chƣơng trình phòng chống sốt rét năm 2015 cả nƣớc có 9331 bệnh nhân sốt rét trong đó tập chung chủ yếu ở ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ [28]. Một trong những khó khăn và là một trong những thách thức trong lộ trình loại trừ sốt rét là ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) đã kháng với hầu hết các thuốc đang dùng, ngoại trừ một số thuốc phối hợp có gốc artemisinin và dẫn chất [103]. Artemisinin và dẫn chất là thành phần quan trọng trong thuốc phối hợp (ACTs) để điều trị sốt rét Plasmodium falciparum (P. falciparum) kháng thuốc [28]. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo sử dụng các loại thuốc ACTs tại nhiều nƣớc, kể cả Việt Nam [103]. Tuy nhiên, đến năm 2005, WHO đã ghi nhận P. falciparum giảm nhạy với ACTs và đến cuối năm 2008 thì báo cáo P. falciparum biểu hiện kháng artemisinin tại tỉnh Pailin, Campuchia – nơi giáp biên giới với Thái Lan, từ đó lan rộng kháng ra 5 nƣớc thuộc Tiểu vùng sông Mê Kông (Lào, Thái Lan, Myanmar, Việt Nam) [103]. Ở Việt Nam thuốc phối hợp dihydroartemisinin- piperaquin (DHA-PPQ) đƣợc lựa trọn đƣa vào điều trị sốt rét do P. falciparum, giai đoạn từ 2005-2010 tỷ lệ đáp ứng lâm sàng đầy đủ (ACPR) từ 97,8% đến 100%, nhƣng sau đó thời gian cắt ký sinh trùng ngày càng kéo dài, ký sinh trùng ngày D3 đã tăng lên nhanh chóng, năm 2012 là 30,6%,2 năm 2014 là 36% (Bình Phƣớc) [16], Gia Lai 24,1% (2015) [12], Khánh Hòa 17,4% D3 (2014) [17].
Gần đây, một số đột biến trong gen K13 đã đƣợc xác định nhƣ các chỉ điểm phân tử liên quan chặt chẽ kháng thuốc artemisinin của P. falciparum trong các nghiên cứu lâm sàng cũng nhƣ tại các chủng tại phòng thí nghiệm [40]. Việc kết hợp dữ liệu phân tích chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 và hiệu lực thuốc dihydroartemisinin-piperaquin phosphate trên các bệnh nhân là cần thiết, góp phần đánh giá chính xác tình hình P. falciparum kháng thuốc tại các vùng sốt rét lƣu hành. Ngoài thử nghiệm in vivo và tìm chỉ điểm phân tử, thử nghiệm in vitro đóng vai trò quan trọng giám sát nhạy-kháng trên các mẫu phân lập P. falciparum thu thập tại thực địa, giúp nhận định tình hình kháng chính xác và quan trọng trong thay đổi chính sách thuốc [40].
Với ý tƣởng kết hợp giữa phân tích các đột biến gen K13 và theo dõi hiệu quả điều trị của thuốc sốt rét dihydro artemisinin – piperaquin trên bệnh nhân là cần thiết, góp phần đánh giá chính xác hơn tình hình P. falciparum kháng artemisinin thuốc tại các vùng sốt rét lƣu hành. Để đánh giá tình hình nhạykháng thuốc trên in vivo, in vitro và các chỉ điểm phân tử K13 liên quan kháng trên quần thể P. falciparum, đề tài luận án “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisinin-piperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành tại Việt Nam” đƣợc thực hiện nhằm các mục tiêu sau:
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị năm 2016 – 2018.
2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin – piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu.
3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai
MỤC LỤC Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………… ……………………………………………………………………………..1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………………3
1.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam …………………………………….3
1.1.1. Sốt rét và một số yếu tố liên quan dịch tễ bệnh sốt rét …………………………..3
1.1.2. Tình hình mắc sốt rét trên thế giới và Việt Nam…………………. ……………….4
1.1.3. Tình hình tử vong do sốt rét trên thế giới và Việt Nam………………. …………6
1.2. Các thuật ngữ và định nghĩa liên quan tới kháng thuốc…………………………….8
1.3. Đột biến gen K13 ….. …………………………………………………………………………10
1.4. Tình hình ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng thuốc sốt rét……….13
1.4.1. Trên thế giới ………. …………………………………………………………………………13
1.4.2. Tại Việt Nam……… …………………………………………………………………………16
1.5. Hiệu lực điều trị, tính dung nạp và độ an toàn của DHA-PPQ……………………18
1.5.1. Tính dung nạp của phối hợp thuốc DHA-PPQ……………………………………18
1.5.2. Hiệu lực điều trị và độ an toàn của phối hợp DHA-PPQ… …………………… 19
1.6. Các kỹ thuật đánh giá kháng thuốc do quần thể P. falciparum ………………..26
1.6.1. Kỹ thuật in vivo đánh giá nhạy – kháng thuốc trên lâm sàng…………………26
1.6.2. Kỹ thuật in vitro đánh giá ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc ……..28
1.6.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử…………………………………………………………..31
1.7. Một số yếu tố thuận lợi cho KSTSR phát triển và hình thành kháng ……….33
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..34
2.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13………. ………..34
2.1.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu……………………………… …………34
2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………………………….37
2.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum………..43
2.2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu …………………………………………43
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………………………….45
2.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum….. …56vii
2.3.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu …………………………………………56
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………………………….57
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………….63
3.1. Mô tả đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 ………………………………63
3.1.1.Đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum…………….63
3.1.2. Phân tích đặc điểm các vị trí đột biến trên gen K13 của P. falciparum ….64
3.1.3. Đặc điểm về đột biến gen K13 của quần thể P. falciparum…………………….68
3.1.4. Tỷ lệ đột biến gen K13 của 5 tỉnh thực hiện nghiên cứu…………………………77
3.1.5. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 của các quần thể P. falciparum ……………81
3.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với…..82
3.2.1. Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu………………………………..82
3.2.2. Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo……………83
3.2.3. Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ ………85
3.2.4. Hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P. falciparum………88
3.3. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét trên in vitro ………..91
3.3.1 Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P. falciparum ………………91
3.3.2. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét……………………….93
3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen k13 của ký sinh trùng P. falciparum…….96
Chƣơng 4. BÀN LUẬN . ……………………………………………………………………………99
4.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của
Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh có sốt rét lƣu hành nặng …………………………..99
4.2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với
thuốc dihydroartemisinin – piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu ……..115
4.3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng P. falciparum với một số thuốc sốt rét
trên thử nghiệm in vitro tại Gia Lai ………………………………………………………….125
KẾT LUẬN …………………. ………………………………………………………………………….133
KHUYẾN NGHỊ …………. ………………………………………………………………………….135
TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI ……………………………………………………………….136viii
MỘT SỐ ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ……………………………….137
NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN…………………………….. 138
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………………139
PHỤ LỤC …………………… ……………………………………………………………………….15
DANH MỤC HÌNH
TT Tên Hình Trang
1.1 Phân bố ký sinh trùng sốt rét năm 2016 tại Việt Nam. 6
1.2 Cấu trúc gen K13 của ký sinh trùng Plasmodium falciparum 10
1.3 Tình hình kháng thuốc artemisinin P. falciparum tại Tiểu vùng Mê
Kông từ 2008-2012
14
1.4 Tình hình kháng thuốc ACT do P. falciparum tại Tiểu vùng Mê
Kông từ 2016-2018
15
1.5 Tình hình ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc artemisinin tại
một số vùng của Việt Nam
18
1.6 Thử nghiệm đánh giá kháng thuốc và ƣu thế từng kỹ thuật 26
2.1 Địa điểm nghiên cứu đƣợc thực hiện tại vùng sốt rét lƣu hành nặng 36
2.2 Lấy lam máu gọt mỏng và giọt dày làm thử nghiệm in vivo 48
2.3 Thu hoạch mẫu máu sau thời gian nuôi cấy thành công invitro 60
3.1 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định vị trí đột biến
1739 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm Bioedit
V.7.0.5.3.
65
32 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến
C580Y trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.
65
3.3 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit
ở vị trí 1658 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm
Bioedit V.7.0.5.3.
66
3.4 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến
P553L trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.
66
3.5 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự ADN xác định đột biến nucleotit
ở vị trí 1406 trên gen K13 của P.falciparum bằng phần mềm
Bioedit V.7.0.5.3.
67x
3.6 Ảnh phân tích gióng hàng trình tự axit amin xác định vị trí đột biến
C469F trên gen K13 bằng phần mềm Bioedit V.7.0.5.3.V.7.0.5.3
67
3.7 Bản đồ phân bố tỷ lệ đột biến gen K13 của ký sinh trùng P.
falciparum tại các điểm nghiên cứu
78
3.8 Biểu đồ so sánh tỷ lệ đột biến gen K13 phát hiện đƣợc tại các điểm
nghiên cứu
81
3.9 Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá phác đồ DHA-PPQ tại
Bình Phƣớc
89
3.10 Đƣờng phân tích Kaplan Meier đánh giá phác đồ DHA-PPQ tại
Gia Lai
89
3.11 Hình ảnh điện di phân tích tái phát, tái nhiễm 90
3.12 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc artesunat 93
3.13 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc
dihydroartemisinin
94
3.13 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc chloroquin 94
3.14 Tỷ lệ ức chế sự phát triển P. falciparum của thuốc piperaquin
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1.1 Các đột biến gen K13 xác định kháng và K13 ứng viên/ hoặc liên
quan
12
1.2 Các gen đa hình và trình tự mồi phân tích tái phát và tái nhiễm 31
2.1 Bảng liều thuốc Arterakin sử dụng cho bệnh nhân nghiên cứu 44
2.2 Cỡ mẫu ƣớc tính dựa vào tỷ lệ thất bại lâm sàng (p) ở quần thể 45
2.3 Quy trình theo dõi bệnh nhân uống thuốc Arterakin 49
2.4 Phân loại đánh giá hiệu quả điều trị theo TCYTTG, 2009 51
2.5 Các biến số, định nghĩa biến số 52
3.1 Đặc điểm chung của bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu 64
32 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Bình Phƣớc 68
3.3 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Bình Phƣớc 69
3.4 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Bình Phƣớc 69
3.5 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Gia Lai 70
3.6 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Gia Lai 71
3.7 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Gia Lai 71
3.8 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Ninh Thuận 72
3.9 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Ninh Thuận 73
3.10 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Ninh Thuận 73
3.11 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Khánh Hòa 74
3.12 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Khánh Hòa 75
3.13 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Khánh Hòa 75
3.14 Đặc điểm đột biến gen K13 tại tỉnh Quảng Trị 76
3.15 Đặc điểm đột biến gen K13 theo giới tính tại Quảng Trị 76
3.16 Đặc điểm đột biến gen K13 theo nhóm tuổi tại Quảng Trị 77
3.17 Tổng hợp kết quả tỷ lệ đột biến gen K13 tại các điểm nghiên cứu 77
3.18 Đặc điểm đột biến gen K13 của 5 tỉnh nghiên cứu 79
3.19 Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo giới tính của 5 tỉnh 80xii
3.20 Tổng hợp tỷ lệ đột biến gen K13 theo nhóm tuổi của 5 tỉnh 80
3.21 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu 82
3.22 Tỷ lệ đột biến gen K13 của các mẫu đƣa vào nghiên cứu in vivo 83
3.23 Đặc điểm đột biến gen K13 của bệnh nhân nghiên cứu in vivo 84
3.24 Hiệu lực làm sạch ký sinh trùng P. falciparum và cắt sốt 85
3.25 Tỷ lệ tồn tại ký sinh trùng thể vô tính sau 72 giờ hoặc ngày D3 86
3.26 So sánh ký sinh trùng ngày D3 với các điểm đột biến gen K13 tại
các điểm nghiên cứu.
86
3.27 Đặc điểm kiểu gen của những bệnh nhân có ký sinh trùng ngày
D3
87
3.28 Hiệu lực phác đồ thuốc DHA-PPQ đối với sốt rét do P.falciparum
tại các tỉnh nghiên cứu
88
3.29 So sánh thất bại điều trị và đạp ứng lâm sàng đầy đủ với các điểm
đột biến gen K13 có liên quan đến kháng artemisinin.
90
3.30 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu đƣa vào thử thuốc 91
3.31 Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công 92
3.32 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc artesunat trên các
mẫu nuôi cấy
96
3.33 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc chloroquin trên các
mẫu nuôi cấy
96
3.34 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc dihydro artemisinin
trên các mẫu nuôi cấy
97
3.35 So sánh đột biến gen K13 và IC50 của thuốc piperaquin trên các
mẫu nuôi cấy
9